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蛋白质测定常用的方法是凯氏定氮法，它是通过测定氮含量从而换算成蛋白质的方法，是国际上通用的标准方法，其优点为实验操作简单、方便，测量结果的重复性和重现性好，而被广泛应用于各类食品、谷物、饲料等样品的蛋白质含量测定中。凯氏定氮法分为常量、半微量、微量法三种方法，其原理是食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵。碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后以硫酸或盐酸标准滴定溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。该方法有取样、样品消化、蒸馏、滴定四个步骤，其原理较为复杂，使用的试剂也比较多，以下将对这四个步骤进行简单讲述。
1 样品的取样
取样应具有代表性，取样前将样品充分混匀，固体试样可用粉碎设备制成细小均匀粉末。称量放入凯氏定氮瓶时，切勿使样品粘附在瓶颈部，避免样品未消化完全而造成氮损失。
2 样品的消化（推荐使用阿尔瓦消解仪）
样品中含氮有机化合物经硫酸在加热的条件下消化，硫酸的作用促使有机物脱水炭化。含氮的有机物炭化并生成碳，碳在将硫酸还原为二氧化硫的反应中，自身则被氧化成为二氧化碳；反应过程中产生的二氧化硫将氮还原为氨气，此过程中其自身则被氧化成三氧化硫；而消化过程生成的氢，又加速了氨的形成。生成的水以水蒸气的形式连同反应过程中生成的三氧化硫一同逸出，而氨气则以硫酸铵的形式留在消化液中。
化学反应方程式为：
2NH2(CH2)2COOH＋13H2 SO4→(NH4)2SO4＋CO2↑＋SO2↑＋16H2O
此过程的注意事项：①样品消化时，对于含糖量很高或含脂量较多的样品，应注意要缓慢升温加热，并随时注意控制加热的温度，避免产生大量泡沫喷出或喷溅到瓶壁上，造成样品的损失。若因加热温度不当，局部温度过高使消化液喷溅到瓶壁上，应及时转动凯氏定氮瓶将溅到瓶壁上的样品消化液冲下，也可在样品消化前加入少量辛醇或液体石蜡，以减少泡沫的产生。②消化时应不定时旋转凯氏定氮瓶，将附在瓶壁上的碳粒冲下，使样品充分消化。③若样品难以消化至澄清透明的程度，可将凯氏定氮瓶从加热器上取下，待其中溶液冷却至室温后，向消化液中加入少量过氧化氢，再继续加热直至完全消化。④整个消化过程中硫酸的量要充足，以保证样品中含氮有机化合物的彻底消化。样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量，因消化时脂肪消耗硫酸的量较大，使硫酸缺少而影响测定。⑤在样品消化末期，即消化液呈蓝绿色并澄清透明后，再继续加热半小时即可，因此时瓶内消化液温度过高，若长时间加热，会使生成的硫酸氢铵分解并释放出氨气，使氮的含量损失，从而影响测定结果。
3 蒸馏
化学反应方程式为：
（NH4）2SO4＋NaOH→Na2SO4＋NH3↑＋H2O
注意事项：①水蒸气发生器中的水要呈酸性，因水中可能含有微量的氨离子，防止其受热溢出而影响测定结果。②蒸馏反应过程中，硫酸铵为强酸弱碱盐，可使消化液为弱酸性溶液。为保证测量结果的准确性，务必使结合态的氨能完全反应并释放出来，因此整个蒸馏过程中，碱液的量不足，酸碱中和反应则不彻底，很难达到使氨充分分离的目的，从而使测量结果不准确。氢氧化钠溶液既能中和样品消化液中过量的酸，又可为氨的有效分离提供一个碱性环境，因此氢氧化钠的用量要控制适当。实验者可利用消化液中含有的铜离子，根据其特征颜色作为碱性反应的指示剂。当反应室内加入氢氧化钠溶液后，其溶液颜色立即变为蓝黑色时，表明氢氧化钠已过量，能达到酸碱反应的要求，可保证反应完全进行。③加氢氧化钠的漏斗要采用水封，避免因蒸馏装置漏气造成氨的溢出而影响测定结果。
4 滴定
氨以气体的形式被释放出来，用硼酸溶液吸收后，使用盐酸或硫酸标准滴定液进行酸碱滴定，从而计算出样品中蛋白质的含量。此过程的注意事项：①硼酸吸收液的温度不宜过高，过高则氨的吸收能力将减弱，会影响测量结果，使结果偏低。保持溶液温度在20℃以下，或将接收瓶置于冷水浴中。②硼酸吸收液的体积不使用精密量取，只要保证能将氨全部吸收即可，因为硼酸的酸性很弱，不会影响滴定。③滴定用的标准滴定液必须按照要求进行配制和标定，因其准确度直接影响测量结果的准确性。④计算蛋白质的含量时须乘以氮换算蛋白质的系数，一般食物为6.25。
5 小结
新鲜食品中的含氮化合物大都以蛋白质为主体，所以检验食品中的蛋白质含量时，只限于测定总氮量，然后乘以蛋白质换算系数6.25，即可得到蛋白质含量。凯氏定氮法可用于所有动、植物食品的蛋白质含量测定，因样品中常含有核酸、生物碱等以及含氮色素等非蛋白质的含氮化合物，所以该法测定结果为粗蛋白质含量。笔者通过参加国家机构组织的“食品中蛋白质的测定”能力检验证，以反复实验为基础，在实验过程中摸索可能影响实验结果的关键点和注意事项，严格把握实验原理，多次推敲与总结，得到上述实验经验。
以上过程现在均可由机器完成，阿尔瓦凯氏定氮仪KN系列就很好的替代了手工测样，并且测定结果优于手工测试！
参考文献
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